前言
台灣保健食品市場規模隨著我國健康意 識提升而成長，2017年通過審查的保健食品 前五大功效訴求為調節血脂、胃腸功能改善、 免疫調節、護肝、骨質保健[1]。根據國內外 研究顯示乳酸菌有改善腸道菌相、增強免疫 功能、降膽固醇、降血脂或減少體脂肪形成 等功效，食品中常以乳酸菌做為益生菌原料。 隨著國人生活水平上升，對於食品衛生要求 愈發嚴格。檢測方法進行含乳酸活菌產品時， 若是以PDA為檢測培養基，檢測結果容易因 乳酸活菌生長於PDA中而有偽陽性。目前市 面上已有多種乳酸活菌產品，然而檢驗乳酸 活菌產品中黴菌及酵母菌時，因乳酸活菌能 生長於PDA上，導致不易判斷產品是否被黴 菌或酵母菌所污染。文獻指出酸可抑制乳酸
菌生長[2]，而黴菌及酵母菌耐酸性較佳[3]， 因此本研究欲以酸液調整PDA之 pH值，在 不影響黴菌及酵母菌生長的前提下，使乳酸 活菌不生長於PDA上。
材料與方法
培養基、試劑 BD DifcoTM Potato Dextrose Broth（馬 鈴薯葡萄糖培養基；PDB）、BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth（乳酸桿菌 MRS 培 養基）、BD DifcoTM Agar（洋菜）皆購買自 啟新生物科技有限公司，新北市。鹽酸(HCl) 購自Sigma-Aldrich（德國）、85%磷酸(H3PO3) 購自第一化工原料股份有限公司（臺灣）、 檸檬酸(Cirtric acid)購自三福化工股份有限 公司（中國）、蘋果酸(Malic acid)購自國華 貿易股份有限公司（日本）。
10%(w/w)酸液製備 將 37%鹽酸、85%磷酸、檸檬酸粉末、 蘋果酸粉末分別加入無菌水中混勻至濃度為
10%(w/w)，以0.22 m filter 過濾至無菌離 心管內備用。
實驗菌種 Lactobacillus plantarum (BCRC 10069)、 Lactococcus lactis (BCRC 12312)、Lactobacillus rhamnosus (BCRC 16000)、Lactobacillus paracasei (BCRC 16100)、Pediococcus pentosaceus (BCRC 10068)、Aspergillus oryzae (BCRC 30289)、Saccharomyces cerevisiae (BCRC 21800)以上菌株皆購自財團法人食品 工業發展研究所生資中心（新竹，台灣）。
菌株活化 乳酸菌菌液製備 : 將乳酸菌冷凍保存管 以無菌接種環沾取至Lactobacilli MRS平板 進行四區劃線，倒置37℃於厭氧環境培養 48±2小時，培養完畢再將單一菌落以無菌接 種環沾取至Lactobacilli MRS Broth中，37℃ 於厭氧環境培養16~18小時。 真菌菌液製備 : 將黴菌或酵母菌之純菌 冷凍保存管以無菌接種環進行四區劃線接種 至PDA平板，正放25℃培養5-7天，活化後 真菌平板以無菌接種環取單一菌落接種至 PDB，培養於25℃培養5-7天備用。
酸化馬鈴薯葡萄糖洋菜培養基（酸化 PDA） 製備 將 PDB 粉末加入總體積2% Agar，以 121℃高溫高壓滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃， 加入先前製備好之酸液由pH 5.1調整pH至 3.8、3.5、3.0與 2.5。 酸化 PDA 配製方法經預實驗結果如表 1，不同酸液調整至pH 3.8 (±0.1)使用酸液量 不同。 由 HCl配製酸化PDA調整至不同pH值 使用酸量如表2。
乳酸菌數檢測 利用傾注平板法進行乳酸菌數計數，操 作方法如下：取乳酸活菌菌液1 mL以 1% peptone water 進行序列稀釋，稀釋至10-6、 10-7，各稀釋液分別取1mL 至無菌培養皿， 再倒入15~20 mL經滅菌完成冷卻至45-50℃ 之Lactobacilli MRS agar，執行平板兩重覆， 待平板冷卻凝固後倒置培養於37℃厭氧環境 48 ± 2小時，培養後計數平板上的單一菌落， 菌落計數範圍介於25~250 CFU 之間，兩平 板菌落數平均後得實驗結果。
黴菌與酵母菌檢測 利用傾注法進行真菌活性檢測，操作方 法如下：將活化好之真菌菌液，經培養後以 傾注平板法培養於PDA 於 25℃培養5-7天， 觀察生長活性狀況。
乳酸菌於PDA上生長活性測試 同上述乳酸菌檢測方式，將乳酸菌以傾 注平板法檢測，培養條件比照黴菌與酵母菌， 培養基使用PDA取代Lactobacilli MRS agar， 倒置培養於25℃培養5-7天，培養後計數平 板上的單一菌落，菌落計數範圍介於25~250 CFU之間，兩平板菌落數平均後得實驗結果。
酸性PDA對於乳酸菌與真菌生長活性測試 乳酸菌實驗方法同上述乳酸菌於PDA上 生長活性測試，使用培養基為酸化PDA，倒 置培養於25℃培養5-7天，培養後計數平板 上的單一菌落，菌落計數範圍介於25~250 CFU之間，兩平板菌落數平均後得實驗結果。 黴菌與酵母菌實驗方法同上述黴菌與酵 母菌檢測，將黴菌、酵母菌以傾注法於各酸 化PDA，正放於25℃培養5-7天，經培養後 觀察菌落型態生長活性狀況。
結果
為評估乳酸菌於PDA之生長狀況，本研 究將乳酸菌活化後經序列稀釋至適當稀釋倍 數後以傾注培養於MRSA及PDA，結果如表 3 所示，乳酸菌以傾注平板法接種於 MRS agar 及 PDA，乳酸菌於兩種培養基皆可生 長，並且其菌落數目無明顯差異。乳酸菌於 MRSA培養基上生長活性較佳，菌落呈白色 明顯肉眼可見，但由於PDA是黴菌與酵母菌 通用培養基，乳酸活菌雖然可以生長於此培 養基上，但對於部分乳酸菌較為不適，而生 長出的乳酸菌菌落形態會偏細小，較不易計 數。 藉由不同酸液調整至 pH 3.8之 PDA 確 認乳酸菌於一般酸化PDA生長活性。由表4 結果顯示部分乳酸菌由調整至pH 3.8 PDA傾 注培養幾乎沒有活性，但是 Lactobacillus plantarum 較為耐酸，活性較強，於 pH 3.8 之 PDA中菌數與MRS agar中菌數無明顯差 異。 以不同酸液調整pH值之PDA皆可抑制 大部份乳酸菌的生長（表4）。以此結果可 推斷以調整 pH 方式可以抑制乳酸菌生長活 性，以 pH 值 3.8之 PDA 雖然可降低大部分 乳酸菌活性，但還是有耐酸特性較強的乳酸 菌無法被抑制，故以 pH 3.8之酸化 PDA 不 足以客觀表現乳酸活菌產品之衛生檢測結果。
討論
依據本研究結果乳酸菌於PDA上生長活 性測試結果證明乳酸活菌可被PDA檢出來。 若以無經處理之PDA檢測含活性乳酸菌之產 品，檢測結果可能會有偽陽性，進而影響品 管檢驗判定。為使品管檢驗更加準確，必須 開發抑制乳酸菌於PDA之生長活性方法。本 研究以一般酸化PDA (pH 3.8)確實可抑制乳 酸菌生長活性，但有部分乳酸菌耐酸度較強， pH 3.8亦可生長。由此可知酸化是一個有效 且可行的方法，但需再作改善，經由再降低 pH至 3.5-2.5的PDA確實能有效抑制乳酸菌 活性，且不影響黴菌與酵母菌生長活性，因 此，將PDA酸化至pH 3.5-2.5範圍內後再檢 驗含乳酸活菌產品，可以使衛生檢驗結果降
低其偽陽性而更加準確。本研究使用一株酵 母及一株黴菌做為測試基準，未來將進一步 測試多種真菌於酸化PDA生長情形，以確認 酸化PDA檢驗適用性。
參考文獻
1. 食品工業發展研究所。2018 食品產業年鑑。 2018.08.08。食品工業發展研究所。台灣。 2. 林志勳。有機酸和乳酸菌之相互關係。現代養豬。 2011; 32:18-20。台灣動物科技研究所， 台灣。 3. 王鳳梅，馬利兵。內蒙古西部地區本土葡萄酒釀酒 酵母發酵特性研究。2015; 31:204-8，生物技術通報。 中國。 4. 衛生福利部食品藥物管理署。食品微生物之檢驗方 法－黴菌及酵母菌數之檢驗。2013。2013.09.06部授 食字第 1021950329 號公告修正。行政院衛生福利 部，台灣。